引言：作为全球血液学领域最大最权威的国际学术盛会之一，第62届美国血液学会年会（ASH）吸引了来自全球多个国家的近三万名血液学专家、学者和其他专业人士参会，会议期间有数千份报告的精彩呈现。来自美国芝加哥医学大学的LucyA.Godley教授在本次ASH会议上报道了他们最新的研究：通过造血系统恶性肿瘤的测序鉴定出潜在的胚系突变。
01
Introduction
骨髓和外周血的下一代测序（NGS）越来越多地指导血液系统恶性肿瘤的临床诊断。NGS数据可能有助于单次测序识别单个核苷酸突变，插入/缺失，拷贝数变异和易位，并且多次的NGS测试可以跟踪患者病程中突变的动态变化。肿瘤细胞可能包含胚系，体细胞和克隆造血DNA改变，而区分突变的病因可能具有挑战性。本文描述了一种通过患者病史，个体突变特征和连续的NGS分析来鉴定潜在胚系突变的方法。我们目前用于鉴定可能具有有害胚系变异的个体的标准包括：单例患者具有强大的家族病史或多种癌症，比一般人群更年轻的诊断为造血系统恶性肿瘤，变异等位基因频率0.3已知种系易感基因中的有害等位基因，尽管疾病状态有所变化，但在临床NGSpanel上仍发现了变异的持久性。对造血标本进行顺序分子检测可以提供对疾病病理的深入了解，影响患者和家属的护理，并有可能识别出易患癌症的新风险等位基因。
02
MethodandResults
一名73岁的白人妇女的个人和家族病史如图所示，家族史显示父亲在75岁时被诊断为“某种血癌”，祖母在60岁时被诊断为“头颈癌”，分子分析通过基因临床NGSpanel鉴定出个总变异。在临床相关性筛选和内部病理学家的个体验证后，有7个（4%）被认定为具有不确定意义的突变，2个（1.1%）DDX41突变在提供给治疗团队的最终报告中被报告为致病性。研究者认为DDX41p.Aspfs突变为潜在的胚系突变，而p.ArgHis突变作为恶性髓系恶性肿瘤的热点获得性突变。因此进一步进行皮肤活检。通过检测培养的皮肤成纤维细胞中的DNA证实了DDx41p.Aspfs是胚系突变。
图1：造血系统恶性肿瘤临床评估中发现的有害DDX41变异体的说明性病例。
鉴定是否是胚系突变需要考虑到病人的家族出血史，低血细胞计数/功能和/或个人/家族癌症史。包括诊断为特定恶性肿瘤的年轻患者、家族中长辈的多发恶性肿瘤和/或长辈2代内出现有造血相关或发病较早的（50岁）实体瘤1。晚期癌症诊断并不排除生殖系易感综合征的可能性。另外，一些遗传性易感综合征可能是由新生基因突变引起的（即在胚胎发生过程中发生的，存在于患者个体的生殖系中，而非亲本），如GATA2，BRCA1，以及BRCA2等2,3。
培养的皮肤成纤维细胞或毛球被认为是胚系DNA的最佳来源。当患者麻醉且皮肤处于无菌环境时，皮肤活检可与骨髓活检同时进行4,5。然而，培养成纤维细胞需要数周时间，而且在技术上很有挑战性，而且在肿瘤患者中，毛鳞状细胞可能很少，并且不能产生大量的DNA，从而限制了下游的检测，且即使选择了合适的材料，生殖系突变的NGSpanel在包含哪些基因和检测到的突变类型方面也存在差异6。因此，确定一个能够对相关基因和突变进行全面测试的小组类型是必不可少的。
体细胞的改变是肿瘤本身所特有的，克隆造血的改变源于造血干细胞或祖细胞的克隆性扩增，而生殖系的变异存在于体内所有的非生殖细胞中。理想情况下，胚系杂合子为VAF~0.5，纯合子为VAF~1.0。然而，VAF必须与胚系嵌合体、杂合性丢失、肿瘤细胞拷贝数变异（CNVs）、插入/缺失、结构重排和测序伪影（包括统计波动，尤其是浅测序深度）相关。因此，需要对来自临床样本的NGS数据进行仔细的解释。建议的初步筛选方法包括根据基因、VAF、纯度和倍数来确定可能的胚系与体细胞状态，然后在可能的体细胞改变中，确定它是否可能来自肿瘤或来自污染造血细胞的常见克隆造血突变。
图2：基于NGS的代表性样本DNA改变的病因。
一些生物信息学算法可能使用单一的NGS分析提示生殖系病因学7,8。然而，随着时间的推移，通过检查测试可以获得更多的信息。第二个病例说明了这一点，该病例突出了一个具有弥漫性大B细胞淋巴瘤、前列腺癌和急性髓系白血病（AML）的个人病史，以及一个很强的癌症家族史，来自骨髓活检的白血病细胞的NGS显示了TP53突变和BRCA1的缺失。患者接受了诱导化疗，临床缓解时的分子分析显示BRCA1缺失和TP53突变缺失持续存在。对从患者培养的皮肤成纤维细胞中提取的DNA进行种系遗传检测，证实存在胚系BRCA1缺失。随着时间的推移，使用已经收集的用于诊断和预后目的的数据跟踪VAF是识别潜在胚系突变的有效方法。其他可能产生稳定的VAF~50%的情况包括持续性疾病、克隆造血、CNVs和杂合子丢失。重要的是要记住，生殖系变异可以是有害的，良性的，或不确定的意义，因此一个变种的生殖系性质不应等同于致病性。
异基因HSCT常被认为是造血系统恶性肿瘤患者的首选。确定一个胚系变异是否具有致病性对于选择捐赠者至关重要，因为一般情况下，家庭成员是首选的9。在本案例中，考虑到家族性BRCA1缺失的潜在风险，在HLA匹配的兄弟姐妹中发现了BRCA1基因缺失，因此他接受了异基因HSCT。如图显示在HSCT之前，在相对较高的VAF下，生殖系BRCA1缺失持续存在；在HSCT之前，患者具有获得性克隆JAK2和TP53突变，移植之后具有供体来源的获得性TSC2突变。随着研究的扩大，评估有害胚系变异对HSCT供体和受体的影响，可以了解哪些是允许成功移植的，哪些是谨慎避免的。
图3：.一个复杂的临床病例中随着时间的推移的VAF的有害变异。
随着NGS测序的临床应用变得越来越普遍，考虑该领域的动态性质是很重要的。可操作突变的数量正在增加，研究人员正在改进使用这些数据的方法10。针对性的个体化药物试验正在进行中，研究人员正在开发新的方法来解释NGS的发现，例如监测可测量的残留疾病，跟踪克隆扩展以了解肿瘤的演变，以及识别新的生殖系癌症易感综合征11。总的来说，讨论挑战和局限性，以及在我们进行更多临床NGSpanel时，向患者披露相关疾病的演变性质可能很重要12。
03
Conclusions
外周血、骨髓或肿瘤标本的NGSpanel用于识别临床上的突变，用于风险分层，并提供疾病诊断建议。样本的解读具有挑战性，如果不能进行系统的胚系检测，家族史或多个癌症诊断、早期诊断、已知胚系易感基因突变的存在、或连续的序列分析中DNA的改变，都应引起对胚系易感的